酰基甘油激酶通过PI3KAKTGSK3

白癜风症状图片及治疗 http://m.39.net/pf/a_5208491.html
AcylglycerolkinasepromotestumourgrowthandmetastasisviaactivatingthePI3K/AKT/GSK3βsignallingpathwayinrenalcellcarcinomaIF:11.

分区:Q1

背景:

临床上，转移性肾细胞癌（RCC）患者的中位生存期仅为6-12个月，5年生存率不到20%。因此，深入研究RCC参与的分子机制对于提高晚期RCC患者的生存具有重要意义。酰基甘油激酶(AGK)是一种新发现的脂质激酶，据报道它是一种有效的致癌基因，可能参与调节多种肿瘤的恶性进展。然而，AGK基因在RCC中的表达和生物学特征仍不清楚

Results

AGKisoverexpressedandcorrelatedwithpoorsurvivalinRCC

蛋白质印迹和PCR显示，与配对的相邻正常组织相比，个人类RCC组织中的AGK蛋白和mRNA表达上调（图1a-c）。一致地，与永生化肾上皮细胞系HK2中的AGK水平相比，AGK在七种RCC细胞系（Caki-1、Caki-2、-O、A、SK-RC-39、P和ACHN）中升高（图1d，e）。此外，AGK表达在高度转移的细胞系ACHN和Caki-1中更高。IHC染色进一步证明AGK在相邻正常组织中几乎观察不到，而在肿瘤组织显著表达（图1f）。

相关性分析显示，AGK表达与临床分期（P?0.）、Fuhrman分类（P?=0.）、转移复发（P?0.）和生命状态（P?0.）密切相关（表1）。AGK表达较高的RCC患者的5年OS（64%对96%，P?0.，图1g）和5年DMFS（57%对95%，P?0.）较差，低于AGK表达低的患者(图1h)。此外，多变量Cox回归分析显示AGK蛋白表达水平和临床分期是RCC患者的独立预后指标（表2）。重要的是，AGK表达增加的患者死亡和转移的风险增加。

Fig.1.AGKisupregulatedinRCCandisassociatedwithpoorprognosisinRCCpatients.

AGKpromotestheproliferationandtumourigenicityofRCC

由于AGK表达与RCC的临床分期相关，我们随后研究了AGK对RCC细胞增殖的影响。我们首先敲低了AGK表达相对较高的RCC细胞系（ACHN和SK-RC-39）中AGK的表达，并上调了AGK表达相对较低的RCC细胞系（A和P）中AGK的表达（图2a）。CCK8和集落形成测定表明，具有增加的AGK表达细胞的增殖速率显着高于相应的对照细胞显著高，而AGK的敲低显著减少细胞增殖（图2b，c）。

EdU和流式分析表明，过表达AGK显着增加了S期细胞的百分比，而AGK的沉默降低了S期细胞的百分比（图2d-g）。

Fig.2.AGKpromotesRCCcellproliferation.

我们接下来通过使用肾脏原位肿瘤模型检查了AGK对体内RCC致瘤性的影响。如图3a所示，在A/oeAGK肿瘤中检测到肿瘤生长显着增加，而与对照ACHN/载体细胞相比，ACHN/shAGK细胞的生长显着减少。HE染色清楚地显示了相邻的正常组织和癌组织。进行IHC检测AGK和Ki67的表达。如图3b所示，与邻近的正常组织相比，AGK在肿瘤组织中显着高表达。此外，A/oeAGK肿瘤中Ki67阳性染色的细胞水平较高，而Ki67的表达在ACHN/shAGK肿瘤中显着降低。这些结果提供了强有力的证据，表明AGK在RCC细胞的增殖中起着关键作用。

Fig.3.AGKpromotesthetumourigenicityofRCCcellsinvivo.

AGKsignificantlyenhancescellmigrationandRCCmetastasis

考虑到AGK表达与复发转移显着相关，我们进一步评估了AGK对RCC细胞转移的影响。伤口愈合测定法和Transwell小室测定显示AGK显著增强细胞迁移和侵入的过表达，而AGK的敲低导致细胞迁移和侵入的明显减少（图4a-c）

我们接下来通过使用肺转移模型检查了AGK对体内RCC转移的影响。4组20只Balb/c裸鼠随机接受A/oeAGK、A/载体、ACHN/shAGK或ACHN/载体细胞尾静脉注射（n?=5/组）。注射后八周，测定并分析肺重量和可见转移淋巴结的数量。如图4d、e，在由A/oeAGK细胞形成的肿瘤中检测到更多数量的转移淋巴结，而由ACHN/shAGK细胞形成的肿瘤比来自载体细胞的肿瘤表现出更少的转移淋巴结。同时，ACHN/shAGK组(80%,4/5)的转移事件发生率低于载体组(%,5/5)。肺转移病灶的HE染色进一步证实了上述结果。总体而言，这些结果表明AGK促进RCC细胞转移

Fig.4.AGKsignificantlyenhancescellmigrationandinvasioninRCC.

AGKpromotesepithelial-mesenchymaltransitioninRCC

GSEA图显示RCC中的AGK表达水平与EMT呈正相关（P?=0.，图5a）。因此，我们检查了EMT是否是AGK诱导的RCC细胞转移的原因。Western印迹表明，与对照组相比，AGK的敲低增加了上皮标志物E-cadherin的表达，并降低了间充质标志物N-cadherin、vimentin和β-catenin的表达水平（图5b)。相反，表达稳定异位AGK的A细胞表达E-钙粘蛋白水平降低和间充质标志物水平升高。此外，鬼笔环肽免疫荧光染色表明AGK蛋白显着改变了RCC细胞的形状。我们注意到，与阴性对照细胞相比，ACHN/shAGK细胞显示出从纺锤状形状变为紧密的细胞间粘附。许多新的尖峰状的凸部和间质型形态在AGK过表达RCC细胞的边缘更清楚地观察到（图5c）。这些结果表明AGK在RCC中促进EMT。

Fig.5.AGKinducesepithelial-mesenchymaltransitioninRCCcells.

AGKpromotesRCCproliferationandmetastasisviathePI3K/AKTpathway

途径富集分析表明，PI3K/AKT信号传导途径是通过显著过表达AGK激活（图6a）。许多研究报道，PI3K/AKT通路通过EMT的调节起着转移的重要作用。因此，PI3K抑制剂LY被用于检测AGK诱导RCC增殖和转移的PI3K/AKT途径的效果。如图6b-f所示，在AGK表达细胞中用PI3K抑制剂LY处理显着抑制了RCC细胞的增殖、迁移和侵袭。Western印迹分析显示AGK下调显着降低SK-RC-39和ACHN细胞中磷酸-PI3K和磷酸-AKT的表达，而P和A细胞中AGK的上调增加磷酸-PI3K和磷酸-AKT的表达。AKT（图6g）。这些观察结果表明PI3K/AKT信号通路在AGK诱导的RCC的功能调节过程中被激活。

Fig.6.AGKstimulatesthePI3K/AKTsignallingpathway.

AGKactivatesGSK3βS9phosphorylationsites,resultingintheinactivationofGSK3β

人类磷酸激酶阵列用于同时检测43个激酶磷酸化位点的相对磷酸化水平。结果显示P和A细胞中AGK的上调增加了GSK3a/β的磷酸化（图7a，b）。我们通过特异性抗体进一步检测了GSK3两种亚型GSK3a和GSK3β的表达。Western印迹表明，AGK表达磷酸GSK3A表达的水平与RCCGSK3β磷酸化水平关联（图7c）所示。类似地，检测到AGK与磷酸化PI3K、磷酸化AKT和磷酸化GSK3β之间呈正相关（图7d）

AGKpromotesβ-catenintranslocationtothenucleusandupregulatesTCF/LEFtranscriptionfactoractivity

由于GSK3β活性已被证明对β-catenin降解很重要，因此β-catenin在细胞质中的积累及其从细胞质中的易位到细胞核中会导致TCF/LEF（T细胞因子/淋巴因子）家族转录因子增强。免疫荧光染色表明AGK显著增加在RCC细胞核β-catenin水平（图7E）。荧光素酶报告基因检测表明，AGK的过表达上调了TCF/LEF家族转录因子的活性，包括细胞周期蛋白D1、c-Myc、Cox2和MMP-7，而AGK表达的敲低降低了细胞周期蛋白D1、c-MYC，COX2和MMP-7（图7F）。总体而言，这些发现表明AGK促进β-catenin易位至细胞核，从而进一步上调TCF/LEF转录因子活性。

Fig.7.AGKactivatesthePI3K/AKT/GSK3βsignallingpathwayandβ-cateninnucleartranslocationinRCCcells.

AGKwaspositivelycorrelatedwithβ-cateninexpressioninhumanRCCsamples

进行IHC以检测同一组人RCC样本中的AGK和β-catenin表达。结果显示，与AGK低表达的组织相比，AGK高表达的RCC组织中异常β-catenin的表达显着增加（图8a，b）。重要的是，在AGK高表达组中，核β-catenin的表达显着增加。蛋白质印迹进一步证明了RCC样本中AGK和β-catenin之间的正相关（r?=0.，P?=0.，图8c、d)。总之，这些发现暗示该AGK激活PI3K/AKT/GSK3β信号传导途径，导致β-catenin的积累和核转录因子的活性随之上调（图8e）

Fig.8.AGKexpressionispositivelyassociatedwithβ-catenininRCCspecimens.

小结：

1.本文中用鬼笔环肽免疫荧光染色看细胞形态是目前我的实验中可以借鉴的，白光图也可以观察细胞形态，但是荧光图更直接美观。

2.本文中的机制和我们平时做的不太一样，先通过药物激活通路进而入核调控疾病的发展。

预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇