BaiLab早报肿瘤抑制因子Tsc1是

摘要

mTOR活性的调节物，肿瘤抑制因子Tsc1和Tsc2形成结节性硬化症。Tsc1稳定Tsc2;然而，所涉及的确切机制仍然难以捉摸。热休克蛋白90（Hsp90）分子伴侣是真核生物细胞稳态机制必不可少的组成部分。在这里，我们发现Tsc1是抑制Hsp90的ATP酶活性的新分子伴侣。Tsc1的C末端结构域（-1,aa）形成同型二聚体并结合Hsp90中间域的两种原体。这确保了对Hsp90二聚体两个亚基的抑制并抑制分子伴侣Aha1与Hsp90中间结构域的结合。相反地，Aha1-Y的磷酸化增加了其对Hsp90的亲和力并将Tsc1置换出来，从而提供了一种HSP90蛋白在两种分子伴侣之间平衡的结合机制。我们的研究结果确立了Tsc1在Hsp90介导的折叠激酶和非激酶分子伴侣-包括Tsc2中的积极作用，从而阻止它们的泛素化和蛋白酶体降解。

结果

1.TSC2是Hsp70和Hsp90新的伴侣蛋白。

A：使用Tsc2抗体或IgG（对照）从HEK细胞裂解物中免疫沉淀Tsc2并用指定的抗体进行免疫印迹以确认分子伴侣之间的相互作用。

B：HEK细胞用10μMJG-98（Hsp70抑制剂）处理指定的时间。通过Western评估Tsc1蛋白质稳定性和Tsc2蛋白质稳定性。

C、D：（C）11MGB或（D）21MSNX-（Hsp90抑制剂）处理HEK细胞达指定时间。通过免疫印迹评估Tsc1蛋白稳定性和Tsc2蛋白稳定性。Akt和phospho-S-Akt用作阳性对照。

E：HEK细胞用50nM硼替佐米（BZ）处理指定的时间，通过免疫印迹对Tsc1和Tsc2蛋白进行评估。

F：50nMBZ加入到HEK细胞中处理1小时，然后加入11MGB处理8小时。另外用BZ或GB单独处理HEK细胞。UN代表未处理的细胞。通过免疫印迹检查Tsc2的稳定性。

G：使用空载体（EV）或Tsc2-FLAG瞬时转染HEK细胞24小时，然后不处理（UN）或用50nmBZ，1μMGB或10μMJG-98处理4小时。免疫沉淀Tsc2-FLAG，用泛素化蛋白抗体进行免疫印迹检测泛素化。

2.新的伴侣分子TSC1抑制Hsp90的ATP酶活性。

A：使用Tsc1抗体从HEK细胞裂解物中免疫沉淀Tsc1，并用指示的抗体进行免疫印迹以确认伴侣蛋白，辅助分子伴侣和结合蛋白相互作用。使用IgG作为对照。

B：FLAG标记的Hsp90aN，M和C结构域的重组体在HEK细胞中瞬时表达，并免疫沉淀。内源性免疫共沉淀（Co-IP）的Tsc1和Tsc2通过免疫印迹检查。空载体（EV）被用作对照。

C：Hsp90a-FLAG，Hsp90b-FLAG及其缺失的TPR结构域结合位点重组体在HEK细胞中瞬时表达并免疫沉淀。通过免疫印迹评估Tsc1的相互作用。HOP被用作阳性对照。空载体（EV）被用作对照。

D：FLAG标记的Tsc1结构域蛋白在HEK细胞中瞬时表达并分离。免疫共沉淀的内源性Hsp70和Hsp90通过免疫印迹评估。空载体（EV）被用作对照。

E：Tsc1-D-HA与FLAG标记的Hsp90aN，M或C结构域在HEK细胞中共表达。Hsp90a-FLAG的不同结构域被免疫沉淀，并且通过免疫印迹评估与Tsc1-D-HA相互作用。空载体（EV）被用作对照。

F：在添加AMPPNP，ADP和GB的条件下，通过荧光各向异性测量在细菌中表达和纯化的Tsc1-D-His6和Hsp90a的结合亲和力。该误差线代表三个独立实验的平均值的SD。

G：Gsp90a在体外的ATPase活性。纯化的Tsc1-D-His6对Hsp90a的ATP酶活性的抑制作用被展示出来。所有的数据代表三个生物学重复实验的标准差。进行学生t检验以评估统计学显着性（**P0.，****P0.）。

H：Hsp90从5只Tsc1GFAPCKO的小鼠中被分离并且测量ATP酶活性，其中TSC1基因主要在神经胶质条件敲除和5只Tsc1flox/+-GFAP-Cre和Tsc1flox/floxlittermate对照（Tsc1-WT）。进行t检验以评估统计学显着性（**P0.）。通过免疫印迹检测来自（H）中样品的Tsc1，Hsp90和伴侣蛋白。SE（短时间曝光）和LE（长时间曝光）。

3.辅助分子伴侣Tsc1与Hsp90的封闭构象结合

A：通过免疫印迹评估在野生型和Tsc1敲除的MEF细胞中内源性Hsp90激酶和非激酶分子伴侣的蛋白水平。

B：通过免疫印迹评估HEK细胞中Tsc1-HA的瞬时过表达及其对Hsp90分子伴侣的表达水平的影响。空载体（EV）被用作对照。

C：HEK细胞中CFTR和Tsc1-FLAG共转染。24小时后通过免疫印迹检测CFTR和Tsc1-FLAG。空载体（EV）被用作对照。

D：Tsc1在体外与Hsp90a-His6相互作用。细菌表达和纯化的Hsp90a-His6与Ni-NTA琼脂糖结合，然后与10ng纯化的Tsc1一起温育。通过免疫印迹检查Hsp90a-His6pulldown和Tsc1共下拉。

E：Tsc1在体外与Tsc2结合。使用抗Tsc2抗体将纯化的Tsc2与重组蛋白G琼脂糖结合，然后与10ng纯化的Tsc1一起孵育。通过免疫印迹评估TSC2和Tsc1共免疫沉淀。

F：Tsc1，Tsc2和Hsp90a在体外形成三聚复合物。细菌表达并纯化的Hsp90a-His6与Ni-NTA琼脂糖结合并随后与10ngTsc1和10ngTsc2在体外温育。通过免疫印迹检查Hsp90a-His6与Tsc1、Tsc2共下拉。

G：来自（D）的样品在4℃用指定的GB处理1小时。通过免疫印迹检查Hsp90a-His6和Tsc1共下拉。

H：来自（E）的样品在4℃用指定的GB处理1小时。通过免疫印迹评估Tsc2和Tsc1免疫共沉淀。

I：（F）的样品在4℃用指定的GB处理1小时。通过免疫印迹评估Tsc2与Tsc1及Hsp90a免疫共沉淀。

J：来自（I）的上清液免疫共沉淀Hsp90a-His6和Tsc1，通过免疫印迹检测结果。

K共伴侣蛋白Tsc1与Tsc2（1）结合并充当一个促进的载体，促进Tsc2与Hsp90直接结合（2），最终导致Tsc1与Hsp90脱离（3）。

4.Tsc1增加Hsp90与ATP和药物的结合

A：来自野生型和Tsc1敲除的MEF细胞裂解液与ATP-琼脂糖一起温育。通过免疫印迹检查Hsp90与ATP-琼脂糖的结合。

B：Tsc1-HA或空载体（EV）在HEK细胞中瞬时表达24小时，随后用ATP-琼脂糖孵育裂解物。通过免疫印迹检查Hsp90与ATP-琼脂糖的结合。

C：在HEK细胞中瞬时表达Tsc1-D-FLAG或空载体（EV）24小时。将裂解物与ATP-琼脂糖一起温育。通过免疫印迹检查Hsp90与ATP-琼脂糖的结合。

D：将来自（A）的裂解物与指定量的生物素化的GB孵育，随后与链霉亲和素琼脂糖珠一起孵育。通过免疫印迹检测Hsp90。

E：将来自（B）的裂解物与指定量的生物素化的GB孵育，随后与链霉亲和素琼脂糖珠一起孵育。通过免疫印迹检测Hsp90。

F：将来自（C）的裂解物与指示量的生物素化的GB孵育，随后与链霉亲和素琼脂糖珠一起孵育。通过免疫印迹检测Hsp90。

G：Hsp90a-FLAGWT及其“开放”D93A“位点或封闭”E47A位点的突变体在HEK细胞中瞬时表达。通过免疫印迹检查Hsp90-FLAG蛋白免疫沉淀，及与内源性Tsc1的免疫共沉淀。

H：Hsp90a-FLAG，D93A和E47A突变体在HEK细胞中与Tsc1-D-HA共表达。检查Hsp90-FLAG及其突变体免疫沉淀，及与Tsc1-D-HA的免疫共沉淀。

5.Tsc1二聚体与Hsp90中间结构域的两个原体结合

A：使用抗Hsp90a/b抗体从野生型和Tsc1敲除的MEF细胞裂解物分离Hsp90，并用Aha1抗体免疫印迹进行检测。

B：Hsp90a-FLAG和磷酸化突变体YF和YE瞬时表达并从HEK细胞中分离。通过免疫印迹检查Tsc1和Aha1的免疫共沉淀。

C：瞬时表达Hsp90a-FLAG和VE突变体并从HEK细胞中分离。通过免疫印迹检测Tsc1和Aha1的免疫共沉淀。

D：Hsp90a-FLAG和Hsp90a-HA在HEK细胞中共表达。首先通过抗FLAGM2亲和凝胶分离Hsp90a-FLAG，然后与FLAG肽竞争。通过使用HA-琼脂糖的第二次免疫沉淀分离Hsp90a-FLAG：Hsp90a-HA异二聚体蛋白。通过免疫印迹检查Tsc1和Aha1的免疫共沉淀。

E：HEK细胞瞬时表达Tsc1-D-FLAG。通过免疫印迹检测Tsc1-D-FLAG和Hsp90及Aha1的免疫共沉淀。

F：Tsc1-D-FLAG和Tsc1-D-HA在HEK细胞中共表达。Tsc1-D-FLAG被免疫沉淀，用免疫印迹检测Tsc1-D-HA的免疫共沉淀。

G：细菌表达的Tsc1-D-His6浓缩至10mg/ml并使用Superdex75柱进行凝胶过滤。蛋白质以单分散的形式迁移，具有约52kDa的表观分子量的峰。

H：Tsc1和Aha1竞争与Hsp90a的结合。Tsc1-D-His6被连接到Ni-NTA琼脂糖上，然后与Hsp90a一起温育。然后洗涤Ni-NTA琼脂糖，与指定量的Aha1-FLAG一起温育。

I：将与抗FLAGM2亲和凝胶连接的IAha1-FLAG与Hsp90a初始温育，然后洗涤并与指定量的Tsc1-D-His6一起温育。

J：Tsc1-D-His6在30分钟后抑制Hsp90aATP酶活性。添加1.3μMAha1-FLAG刺激ATP酶活性。所有的数据三个生物学重复的标准差。进行t检验以评估统计学显着性（*P0.05，***P0.0）。

6.磷酸化Aha1替代Hsp90中的Tsc1

A：将Tsc1-D-His6连接至Ni-NTA琼脂糖，然后与Hsp90a一起温育。然后洗涤Ni-NTA琼脂糖并与指定量的磷酸化Aha1-YE-FLAG孵育。

B：通过GAL1-TSC1-FLAG转化表达yHsp90或Hsp90a作为Hsp90的唯一拷贝的BPP30酵母菌株，在棉子糖（Raf）上生长过夜。该细胞转移至半乳糖（Gal）培养基4小时。通过免疫印迹评估Tsc1-FLAG的表达。Sba1被用作加载对照。

C：（B）中的C菌株在YPED或YPGal培养基上以1:10稀释比例被发现。平板在30℃孵育2天。

D：（B）中的酵母菌株也用ADH1-AHA1或磷酸化突变体YE转化。细胞在与（B）类似的条件下生长并且表达，通过免疫印迹检查Aha1，Tsc1-FLAG和Hsp90a。

E：来自（D）的酵母菌株在YPED或YPGal培养基上以1:10稀释系列被发现。平板在30℃孵育2天。

F：野生型和Tsc1敲除的MEF细胞在裂解之前，用20μMDPH（c-Abl激活剂）处理6小时。免疫印迹检查Hsp90（Hsp90a/b）的免疫沉淀和Aha1和Tsc1的免疫共沉淀。

G：野生型和Tsc1敲除的MEF细胞在裂解之前，用5μMGNF-5（c-Abl抑制剂）处理24小时。免疫印迹检查Hsp90（Hsp90a/b）的免疫沉淀和Aha1和Tsc1的免疫共沉淀。

H：Hsp90（Hsp90a/b）从野生型和c-Ablα/β型MEF细胞裂解物中免疫沉淀。免疫印迹检测Aha1和Tsc1的免疫共沉淀。

I：Hsp90（Hsp90a/b）从用siRNA敲减TSC1的c-Ablα/βMEF细胞中免疫沉淀，免疫印迹检测Aha1和Tsc1的免疫共沉淀。

7.Tsc1辅助分子伴侣对Hsp90分子伴侣周期的影响

（1）在没有核苷酸的情况下，Tsc1弱结合Hsp90“开放”构象。

（2）ATP与Hsp90的N端结构域结合后，Tsc1相互作用加强Hsp90的“封闭”构象。

（3）c-Abl介导的Aha1-Y磷酸化取代Hsp90中的Tsc1。

（4）在伴侣周期的后期，预计p23会驱逐Hsp90上的磷酸化Aha1-Y，

（5）使Hsp90水解ATP。

讨论

在这项研究中，我们证明Tsc2是热休克蛋白70和热休克蛋白90一个分子伴侣，因为细胞治疗用Hsp70或Hsp90抑制剂导致Tsc2泛素化和蛋白酶体降解。我们进一步证明Tsc1是一种新的伴侣的Hsp90。Tsc1羧基结构域（-1,aa;Tsc1-D）作为同型二聚体存在并与HSP90中间域相互作用。nM的Tsc1-D足以抑制或减缓Hsp90ATPase活性降低72％。相反，与来自对照样品的Hsp90相比较，从小鼠分离具有条件性失活Tsc1的大脑的Hsp90具有更高的ATP酶活性。此外，这些样品中Tsc1的失活导致下调激酶如ErbB2和Ulk1以及非激酶分子伴侣蛋白如雌激素受体（ER）和GR。这与我们来自Tsc1敲除MEF细胞的研究结果相一致的，可能因为Hsp90的分子伴侣周期较慢，在HEK细胞中Tsc1的过度表达也下调激酶蛋白，但稳定了类固醇激素受体和非激酶分子伴侣如FLCN和CFTR。我们的发现表明Tsc1新发现的功能是调控Hsp90的分子伴侣包括Tsc2。像其他辅助伴侣一样如Cdc37和HOP，Tsc1表现为促进分子伴侣相互作用，在这种情况下，也可以设想Tsc1调节Hsp70的分子伴侣功能，也许像HOP一样，连接Hsp70和Hsp90之间的信息传输。

先前的研究显示致病性错义突变的Tsc1在其N结构域中可以使Tsc1蛋白质不稳定（Hoogeveen-Westerveld等，,）。我们已经证明了致病突变体LP-Tsc1是不稳定的并且也阻止Tsc2结合到Hsp90。这导致了蛋白酶体介导的降解导致Tsc2的不稳定。Tsc1相互作用和抑制Hsp90的机制是什么？Hsp90分子伴侣周期与其结合水解ATP能力有关（Panaretou等，1）。

这产生构象变化，其中Hsp90二聚体N末端“打开”状态变为“闭合”构象。TSC1喜欢结合封闭构象突变E47A而不是开放状态突变体D93A。虽然Tsc1-D片段与Hsp90的中间结构域相互作用，但是MEEVD基序（缺失）的缺失TPR域结合位点）完全在Hsp90的C末端消除Tsc1与Hsp90的结合。我们的数据表明，Tsc1与Hsp90的结合是复杂的，并且需要多个Tsc1的表面与Hsp90相互作用。Tsc1也不相与Hsp90复合物与Aha1，p23或HOP辅助伴侣的结合。因为Tsc1和辅助伴侣Aha1都结合中间域和不存在于相同的Hsp90复合体中，我们检查了Aha1结合Tsc1相互作用的位点突变体，Hsp90a-V参与Aha1-N与Hsp90a中间结构域的相互作用（Meyer，等人）。Hsp90a-VE突变体不结合Aha1或Tsc1。有趣的是，虽然VE只有一个Hsp90中间结构域突变前体结合Aha1，这种突变体不与Tsc1交互。我们得出结论，Tsc1二聚体需要结合Hsp90中间结构域的两个原体。这一观察也为Tsc1与和之竞争，掩蔽Aha1和p23与Hsp90结合提供了解释（图7）。因为Tsc1与Hsp90中间域的Aha1结合位点相互作用，我们预测Tsc1可以防止催化中的构象变化从而抑制Hsp90ATP酶活动。

Tsc1对Hsp90具有高亲和力并显着增加Hsp90与核苷酸或N-结构域抑制剂的结合。相反，在体外需要差不多倍的Aha1蛋白来置换Tsc1-D。我们以前已经表明c-Abl磷酸化Aha1-Y增加Aha1与Hsp90的结合（Dunn等），）。这些结果显示Tsc1是Hsp90的激酶和非激酶分子伴侣的促进因子，Tsc1作为Hsp90的新分子伴侣。我们在这里显示的Tsc1丢失会导致Hsp90分子伴侣功能和分子伴侣蛋白不稳定性的失调包括Tsc2。目前还不清楚是什么效应使Tsc1的失活和由此产生的Hsp90活动过度。

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