溶瘤病毒综述二溶瘤病毒与其他疗法

抗病毒与抗肿瘤免疫

溶瘤病毒感染可导致针对病毒和肿瘤细胞的固有和适应性免疫反应的激活。溶瘤病毒的治疗效果取决于病毒免疫原性和抗肿瘤免疫之间的平衡(图1)。这种平衡在于避免过早清除病毒，让病毒有足够的时间复制和杀死肿瘤细胞，并启动抗肿瘤免疫。病毒清除是通过两个主要机制进行的：被感染细胞内的干扰素信号通路通过干扰细胞内病毒的生命周期来检测和清除这些病毒；固有和适应性免疫反应识别病毒颗粒和/或病毒感染细胞并将其清除。许多病毒进化出复杂的策略来避免被免疫系统发现，这有助于解释为什么溶瘤病毒可以，至少是暂时持续存在并避免免疫清除，从而有足够的时间产生抗肿瘤免疫反应。

图1溶瘤病毒治疗癌症的抗病毒抗肿瘤免疫

抗病毒免疫。正常细胞被病毒感染后，细胞内抗病毒机制通过TLR、MDA5（也称为IFIH1)和RIG1等细胞表面受体和细胞质受体检测病毒颗粒，它们能够检测到暴露在病毒颗粒上的PAMP。反过来，膜结合的TLR7、TLR8和TLR9激活MYD88信号，从而激活JAK-STAT信号通路信号，导致了编码I型干扰素和p21、PKR、OAS、胱天蛋白酶、促炎细胞因子和趋化因子等其他干扰素相关分子的基因表达。这些酶是协同病毒清除机制的组成部分，PKR磷酸化诱导受感染细胞的转录停滞，p21诱导细胞生长停滞，OAS的激活诱导RNA沉默，胱天蛋白酶依赖性凋亡诱导细胞死亡。I型干扰素还上调MHCI类分子等抗原处理和抗原提呈机制的表达。因为宿主细胞转录受到抑制，这里存在一个通过MHC复合物向病毒肽提呈的转换，促进了适应性免疫系统对受感染细胞的识别。病毒感染的细胞产生I型干扰素和趋化因子，可招募和激活固有淋巴细胞，并增加肿瘤细胞免疫检查点分子的表达，这使得它们更容易受到检查点阻断的影响。其他TLR激活替代信号通路如，TLR3通过TICAM1（也称为TRIF）识别病毒RNA和信号，激活I型和II型干扰素的产生。此外，cGAS-STING系统能够检测病毒DNA，启动信号级联，通过释放趋化因子激活干扰素通路和淋巴细胞的募集。肿瘤细胞的抗病毒机制可能有缺陷，与被感染的正常细胞相比，病毒在肿瘤细胞中能存在更久并更易复制。

抗肿瘤免疫。尽管适应性免疫反应比固有反应晚出现，但它有两个重要特征：特异性，能够高度特异性地识别个体病毒蛋白；记忆，再次暴露于同一病毒后能够更快地反应。当病毒抗原的处理和提呈由启动CD8+T细胞的BATF3+DCs进行时，适应性免疫反应最有效。受感染组织区室中的局部趋化因子梯度帮助细胞毒性CD8+T细胞迁移回病毒感染部位，并直接裂解感染细胞以阻止病毒的进一步传播。类似的过程也发生在抗肿瘤免疫中，并涉及肿瘤相关抗原的识别。

因此，直接将溶瘤病毒注射到肿瘤中为BATF3+DC的成熟及抗原提呈提供了至关重要的信号，这对于启动病毒特异性T细胞和肿瘤特异性T细胞至关重要，并且可以形成一个局部炎症环境，促进T细胞的募集以及它们对肿瘤细胞的识别和消灭。许多病毒还通过诱导在效应B细胞内成熟的病毒特异性B细胞来激活体液免疫。抗病毒抗体应答的诱导使监测病毒感染更为便利，尽管这些抗体(即中和抗体)对病毒清除的效果取决于病毒类型和被感染的细胞类型。

治疗基因的表达

病毒可以被改造以递送优先在肿瘤细胞中表达的细胞毒性基因产物，或增强免疫反应的免疫调节基因。招募T细胞并调节T细胞稳态的细胞因子基因是最常见的免疫调节基因之一。GM-CSF是一种调节细胞因子，在DC等抗原提呈细胞的募集和成熟中发挥作用。由工程化的溶瘤病毒产生的GM-CSF刺激DC成熟，并将DC募集到肿瘤细胞破裂的部位，由DC吸收可溶性肿瘤抗原，从而促进T细胞启动。编码IL-2、IL-12、TNF或其他细胞因子的病毒已经被工程化改造以刺激淋巴细胞群在局部启动后的扩张，并且这些病毒的治疗活性已经在小鼠肿瘤模型中得到验证。另一种策略是设计一种编码肿瘤相关抗原的溶瘤病毒，旨在通过最初的抗病毒反应来引导针对肿瘤细胞的抗原特异性反应。或者，溶瘤病毒可以被工程化改造以表达T细胞共刺激分子，从而促进肿瘤细胞感染后的T细胞激活。由于病毒为信号1(通过TCR的抗原依赖性信号)提供了强抗原表位，共刺激分子的存在能够对病毒免疫原性产生巨大影响。表达共刺激分子CD80或三种共刺激分子(CD80、ICAM1和LFA3)的工程化牛痘病毒在小鼠黑色素瘤模型中显示出活性，这证明了安全性并为早期临床试验中肿瘤消退提供了证据。溶瘤病毒驱动的阻断T细胞抑制的T细胞检查点分子的表达也可能是一种有效的治疗方法。

自杀基因疗法也可以与溶瘤病毒一起使用，以增加对肿瘤细胞的杀伤。这种方法选择性杀死表达将惰性前药转化为细胞毒剂的酶的细胞。例如，溶瘤病毒驱动的胞嘧啶脱氨酶的表达，将无毒的前药5-氟胞嘧啶转化为有毒的抗癌药物5-氟尿嘧啶，导致被感染的肿瘤细胞死亡。一种类似的策略涉及肿瘤细胞特异性HSV-1驱动的胸苷激酶表达，这种表达将惰性更昔洛韦转化为毒性更昔洛韦单磷酸酯，已经被试验作为胰腺癌的治疗方法。另一种方法是利用控制关键细胞功能的microRNA元素。这些策略在临床前动物模型中有效，但尚未在临床试验中得到验证。

对肿瘤新生血管的影响

溶瘤病毒还可以阻断肿瘤细胞通过激活内皮细胞诱导血管生成。例如，肿瘤细胞的水泡性口炎病毒感染阻断了新生血管的形成，直接破坏了营养物和氧气向肿瘤的输送，并引发肿瘤微环境中的炎症，包括对引发局部微血栓形成的中性粒细胞的募集。此外，VEGF-VEGFR2通过ERK1或ERK2和STAT3发出信号，可能导致转录抑制因子PRDM1(也称为BLIMP1)的激活及核定位。PRDM1抑制I型干扰素基因表达，导致抗病毒机制失活，并促进溶瘤病毒复制和病毒在肿瘤微环境中的持久性。

溶瘤病毒也可以被工程化改造以增加淋巴细胞粘附受体或共刺激分子的内皮细胞表达，这可以分别增加肿瘤微环境中淋巴细胞的募集或局部T细胞的激活。肿瘤内皮上不同病毒的影响还需要进一步研究以更好地理解这种机制对溶瘤病毒整体抗肿瘤活性的贡献。

发展中的组合方法

迄今为止，只有T-VEC一种溶瘤病毒被批准用于癌症治疗。T-VEC是一种减毒HSV-1，能够表达GM-CSF。尽管注射病灶比远端病灶具有更强的反应，但在T-VEC的III期临床试验中，客观缓解和持久响应有所改善，这表明更强的免疫反应激活是有效果的。事实上，动物模型的临床前研究已经证实，联合方法可以改善治疗反应，其中包括溶瘤病毒与细胞毒性化疗、靶向分子药物、放射治疗等癌症疗法及其他形式的免疫疗法的联合使用。这些免疫疗法包括细胞因子、过继性T细胞疗法(ACT)及免疫检查点抑制剂等。早期临床试验进一步验证了基于溶瘤病毒的组合策略，这些试验报告了提高的客观缓解率和可耐受的安全性。在这一节中，我们简要回顾了使用溶瘤病毒作为联合治疗基础的理论基础(图2)，并讨论了各种策略如何能够增强溶瘤病毒介导的癌症免疫周期缺陷纠正。

图2溶瘤病毒作为联合治疗癌症的基础

但值得注意的是，尽管联合治疗的疗效富有前景，但关于不同治疗的最佳剂量和时间安排的数据有限，同时缺乏对于适合溶瘤病毒联合免疫疗法患者资格的共识，对监测这种方法有效性的研究终点也缺乏一致意见。

化疗和靶向治疗。细胞毒性化疗和靶向治疗杀死肿瘤细胞，导致可溶性抗原的释放，并增强溶瘤病毒诱导的新抗原库的扩展。ONYX-是一种E1B缺失的腺病毒，它优先在p53缺陷的人类肿瘤细胞中复制，并且已经在各种癌症的临床试验中进行了试验。化疗药物顺铂、5-氟尿嘧啶和ONYX–的联合治疗，注射肿瘤的反应率为65%，而单独使用ONYX-的反应率仅为15%。反应率提高的原因尚不清楚，但这可能是由于肿瘤细胞死亡以及进入暴露于化疗的肿瘤细胞的病毒的增加。靶向治疗抑制癌细胞中异常的信号通路。与单独使用呼肠孤病毒相比，使用BRAF抑制剂、MAPK-ERK激酶(MEK)抑制剂和呼肠孤病毒3型(在含有导致RAS-MAPK信号激活的突变的细胞中选择性复制)的联合治疗通过ER应激诱导凋亡增强了体外细胞杀伤。

免疫检查点阻断（Immunecheckpointblockade）。ICB被广泛用于治疗癌症，在部分患者中具有持久的临床反应。临床反应与此前存在的抗肿瘤免疫反应相关，如TIL数量增加、高突变负荷以及广泛的新抗原库的出现。使用ICB和溶瘤病毒的联合疗法很有吸引力，因为溶瘤病毒可以将TIL招募到免疫缺陷肿瘤中，并触发可溶性肿瘤抗原、危险信号和促炎细胞因子的释放，进一步增加T细胞的募集并促进免疫细胞激活。病毒感染会增加阻断T细胞激活(因此也是抗肿瘤免疫)的CTLA4、PDL1和其他免疫检查点分子的表达，但也会增加肿瘤对ICB的敏感性。使用B16-F10黑色素瘤进行的临床前研究表明，局部注射溶瘤新城疫病毒的肿瘤会诱导肿瘤特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润到注射肿瘤和远端肿瘤中，并增加肿瘤对系统性CTLA4阻断的敏感性。在三阴性乳腺癌的临床前模型中，溶瘤马拉巴病毒具有作为新辅助疗法的治疗活性，使难治性肿瘤对ICB敏感。其他几种溶瘤病毒，如B18R缺陷型牛痘病毒和表达黑色素瘤抗原库的水泡性口炎病毒，与ICB联合也显示出显著的疗效。

在19例晚期黑色素瘤患者的Ib期临床试验中，瘤内T-VEC给药后，加入标准静脉内剂量(每千克3毫克)的抗CTLA4抗体ipilimumab。没有观察到剂量限制毒性，客观缓解率为50%,44%的患者具有持续6月以上的持久性反应。对例不可切除IIIB–IV期黑色素瘤患者进行随机临床试验，T-VEC和ipilimumab联合治疗对比单独使用ipilimumab，患者反应率显著提高(38%对比18%)。虽然对每种治疗都有典型的单一药剂不良反应,但联合治疗的不良反应的发病率或严重程度并没有增加。在接受联合治疗的患者中检测到激活的CD4+T细胞和CD8+T细胞水平的增高。采用T-VEC和抗PD1单克隆抗体pembrolizumab的联合治疗方法对21例黑色素瘤患者进行了I期临床研究。虽然样本量较小，但报告了62%的客观缓解率和空前的33%的完全缓解率。目前正在进行一项更大的随机III临床期试验,以评估这一组合与单独使用pembrolizumab的对比。此外,联合使用溶瘤柯萨奇病毒(CVA21)和ipilimumab治疗各种实体肿瘤患者正在被评估,在一项CVA21和pembrolizumab联合治疗黑色素瘤患者的临床试验中，其早期分析报告了可喜的结果。

过继性T细胞治疗。ACT的持久响应取决于供体T细胞运输到并在肿瘤床存活。用溶瘤病毒对已有的肿瘤进行预治疗,可形成局部肿瘤微环境,改善T细胞的募集和效应功能。除提高适应性T细胞的浸润外,溶瘤病毒诱导的肿瘤细胞坏死和凋亡能够触发肿瘤新抗原和抗原表位的释放,通过BATF3+DC促进新抗原特异性CD8+T细胞的启动,从而促进决定基扩散。溶瘤病毒增加癌细胞的MHCI类分子表达的能力能够提高靶向肿瘤特异性抗原的ACT疗效。一项联合使用针对肿瘤相关的神经节苷脂GD2的CAR-T细胞和表达编码趋化因子CCL5和IL-15基因的溶瘤腺病毒(Ad5Δ24)的临床研究中，小鼠神经母细胞瘤模型中总生存率增加,并显示提高的CAR-T细胞功能和存活能力。由于CAR-T细胞治疗在实体肿瘤中表现出有限的疗效,与溶瘤病毒联合治疗这些实体瘤值得进一步研究。

放射疗法。放射治疗与ICB联合能够产生远端效应。通过辐射介导的病毒溶瘤的增强和病毒介导的细胞对放射疗法的敏感性，溶瘤病毒和放射疗法的结合在许多临床前模型中提高了抗肿瘤活性。电离辐射造成DNA以单链和/或双链DNA断裂的形式损伤。一些溶瘤病毒隔离DNA损伤反应蛋白，抑制DNA修复机制，实质上充当辐射敏化剂。例如，HSV-1ICP34.5包含与GDADD34（也称为PPP1R15A）同源的结构域。GDADD34mRNA随着肺癌的辐射损伤而上调，HSV-1与放疗的联合治疗在小鼠中显示出协同抗肿瘤活性。在对17名头颈部鳞状细胞癌患者的I-II期临床试验中，顺铂化疗联合瘤内注射持续增加剂量的T–VEC，随后在治疗后6-10周进行颈部解剖。17例患者中的14例对治疗具有响应，93%的患者经组织病理学证实得到完全缓解。随访时(中位29个月)，没有证据表明局部复发，疾病特异性生存率为82%。优化辐射照射和溶瘤病毒治疗的时机可能很重要，因为局部辐射治疗可能会阻止病毒复制或免疫细胞募集。

溶瘤病毒治疗的生物标志物

通过分析生物标志物，可以更好地了解溶瘤病毒感染的时间进程及其对肿瘤的影响。目前，尽管有几个潜在的生物标志物可以被包括在未来的临床试验中，但是溶瘤病毒感染和治疗的有效生物标志物并不存在。几种肿瘤内在机制可能介导对溶瘤病毒的抗性，包括抗病毒反应和致癌信号通路。因此，这些通路的组成，包括干扰素信号元件、PKR、cGAS-STING、OAS、Rg1和各种TLR，是溶瘤病毒治疗中潜在的生物标志物。此外，与免疫激活有关的肿瘤外在机制可能与溶瘤病毒有关。因此，生物标记可以包括免疫细胞的数量、密度和定位，如自然杀伤(NK)细胞、BATF3+DC、Treg细胞、CD4+T细胞，及病毒特异性和肿瘤特异性CD8+T细胞。在接受T-VEC和pembrolizumab联合治疗的患者中，与单独使用pembrolizumab相比，在更高百分比的反应性病变中观察到激活的的CD8+T细胞募集。

局部干扰素应答可能导致局部的PDL1表达代偿性增加。CTLA4、LAG3和HAVCR2等其他检查点分子水平在溶瘤病毒治疗后也可能增加。此外，PD1表达的缺失与对PD1或PD1导向的ICB的抗性相关。溶瘤病毒治疗是否能通过上调肿瘤微环境中的检查点来逆转检查点抑制剂抗性有待进一步研究。其他与免疫治疗临床反应相关的因素包括高肿瘤细胞突变负荷和寡克隆新抗原T细胞库的出现。尽管溶瘤病毒的活性可能不受突变负荷的影响，但是肿瘤中病毒抗原的存在可以被视为高突变负荷的替代物，因此需要对低突变负荷肿瘤中溶瘤病毒的活性进行评估。

大多数溶瘤病毒的临床试验集中于肿瘤内递送，以最大化病毒在肿瘤细胞中的生物分布，并避免系统体液免疫反应中和病毒。瘤内给药的主要缺点是难以接近深部内脏肿瘤或位于中枢神经系统内的肿瘤，尤其是需要重复给药时。尽管疗效有待临床验证，但已有溶瘤病毒静脉注射成功的报道。一种编码人碘化钠转运体的溶瘤麻疹Edmonston病毒，在32名多发性骨髓瘤患者中使用静脉内给药途径进行了试验。在这个剂量增加的I期临床试验中，一名患者有完全反应，这表明病毒在肿瘤细胞中的复制早于免疫介导的清除。尽管令人鼓舞，但由于样本量相当小，且一些患者接受了环磷酰胺作为治疗方案的一部分，以及骨髓瘤的反应可能无法说明实体瘤的疗效，这项研究的意义有限。在另一项研究中，静脉注射溶瘤呼肠孤病毒治疗高级别胶质瘤患者证实了肿瘤细胞的病毒感染，促进了局部干扰素介导的PD1表达的增加以及肿瘤切除后细胞毒性T淋巴细胞的募集。但还需要进一步的研究来确定静脉注射溶瘤病毒的潜在功效。

溶瘤病毒的递送方法

最佳的给药策略富含争议。尽管瘤内给药在临床上是有效的，但对于其他给药方法，疗效证据有限。每种方法的主要优点和缺点详述如下。

瘤内递送

瘤内递送仍然是标准递送途径。瘤内递送途径的优势包括在临床试验中的有效性；肿瘤溶解效果的增强以及在肿瘤微环境中最佳细胞杀伤和复制病毒定位的情况下可能增加的系统性抗肿瘤免疫反应。肿瘤内递送的潜在缺点包括需要通过临床触诊或介入技术来接近肿瘤，需要根据肿瘤负担为每个患者定制剂量和部位选择，并需要对医护人员进行教育培训。

静脉输送

静脉内给药避免了定位每个肿瘤进行注射的挑战，并且能够对所有患者使用单一给药方案，这具有明显的优势。静脉输送旨在更有效地将病毒输送到无法到达的肿瘤部位，这是一种更简单的方法。理论上，病毒可以感染正常细胞而不复制，而只有被感染的肿瘤细胞才允许病毒复制。但静脉输送仍然存在一些缺陷，预先存在的中和抗病毒抗体和其他免疫反应导致病毒被快速清除，从而限制了病毒的生物分布。此外，病毒与其他血清蛋白的结合，以及血液中相当大的稀释效应限制了病毒有效地输送到肿瘤部位。

胸膜内、腹膜内和膀胱内给药

这些方法的优点是将病毒定位到更大的区域，从而达到更好的肿瘤递送，尽管不如瘤内递送，但是当肿瘤分散在这些区域内时，这些方法可能是有用的。这些方法的缺点包括有限的生物分布和更快速的病毒清除速度。中枢神经系统是一个特殊的位置，因为许多病毒无法穿过血脑屏障，尽管直接输送能够消除这种担忧。通过将留置导管留在适当的位置可以持续访问这些部位，尽管留置导管不会将病毒直接递送到肿瘤部位，而且与瘤内或静脉递送相比，这些部位中的每一个都有更高的感染几率。

细胞载体

细胞载体是另一个正在被积极探索的策略。在这种方法中，选择的细胞由体外溶瘤病毒进行感染，然后通常通过静脉输注回体内。然而，这种方法有许多先决条件：所选细胞必须允许溶瘤病毒感染；它们必须前往肿瘤生长的部位；它们必须保护溶瘤病毒免受循环中免疫检测的影响；一旦与肿瘤细胞接触，他们必须有效释放病毒。最有希望的细胞载体包括肿瘤干细胞，因为它们对可能存在肿瘤细胞的原生组织具有趋性，以及已经被工程改造成能够运输到肿瘤生长部位的免疫细胞。

结论和未来方向

溶瘤病毒在治疗人类肿瘤方面已经显示出有效性，新出现的临床数据为溶瘤病毒与其他癌症疗法，特别是与其他免疫治疗药物联合治疗提供支持。溶瘤病毒可以影响癌症免疫周期的几乎所有方面，因此它们的抗肿瘤活性通过多种机制发生，为增强癌症免疫治疗提供了多种机会。溶瘤病毒可以将TIL招募到肿瘤微环境中，并在此过程中改变免疫沙漠和免疫排斥。此外，溶瘤病毒有助于维持效应TIL表型，从而有可能逆转免疫浸润微环境中的免疫抑制。溶瘤病毒优先在肿瘤细胞中复制及局部递送溶瘤病毒的可能性提供了一种增强肿瘤细胞靶向性并防止系统清除和自身免疫症状的方法。

尽管许多其他类型的治疗可以与溶瘤病毒联合使用，但是ICB在早期临床试验中最引人注目，因为已经观察到增加的治疗反应且没有增加毒性。溶瘤病毒治疗中最佳病毒的选择以及最佳剂量、给药途径和时间表需要进一步研究。尽管肿瘤特异性T细胞反应似乎对免疫介导的肿瘤排斥至关重要，但病毒特异性T细胞反应的贡献需要得到阐明。

对溶瘤病毒扩大了新抗原特异性T细胞库的证实是另一个重要的研究目标。随着该领域的发展，环境和/或宿主因素，如饮食和肠道微生物群，对溶瘤病毒治疗的影响也可能是令人感兴趣的。最后，随着对个体肿瘤如何抑制抗肿瘤免疫反应的理解的提高，有可能设计出更有针对性的组合方法来恢复有效的宿主抗肿瘤免疫。溶瘤病毒的多样性和安全性表明，它们是优化联合免疫治疗的理想药物。

资料来源：

Bommareddy,P.K.,Shettigar,M.Kaufman,H.L.Integratingoncolyticvirusesin







































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