肿瘤脊髓灰质炎病毒受体和CTLA4在手术

摘要

前言：脊髓灰质炎病毒受体(PVR)是肿瘤的启动子和增强免疫抑制的检查点。应用免疫组织化学(IHC)法检测PVR的表达。手术切除的非小细胞肺癌(NSCLC)患者PVR表达与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)表达呈正相关。PVR表达可作为预测肺腺癌预后的指标。

目的：探讨PVR和CTLA4在手术切除非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其预后意义。

患者与方法：回顾性分析例手术治疗的原发性非小细胞肺癌患者的临床资料。免疫组化检测PVR和CTLA4的表达。分析PVR的临床特点、PVR与CTLA4的关系以及PVR的预后意义。

结果：PVR与CTLA4在非小细胞肺癌中的表达呈显著正相关(P=0.)。PVR在女性、非吸烟者、腺癌和晚期肺癌患者中阳性率较高。PVR表达阴性患者的总生存期(OS)明显长于PVR表达阳性患者(P=0.)，尤其是女性患者(P=0.03)和非吸烟者(P=0.)。多因素分析结果显示，晚期肿瘤分期和PVR表达是预后不良的独立预测因素。

结论：PVR可作为非小细胞肺癌和肿瘤抗CTLA4免疫治疗反应的预测指标和生物标志物。

前言

肺癌是中国和全世界癌症死亡的主要原因，死亡率和发病率都很高。非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常见的组织学亚型，占肺癌病例的85%以上。尽管目前在外科、化疗、放疗和分子靶向治疗方面取得了进展，但非小细胞肺癌患者的5年总生存率（OS）仍然不能令人满意。免疫检查点抑制剂(ICIS)的应用，如程序性死亡1(PD-1)/程序性死亡配体1(PD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)，已经成为一种临床治疗模式，并导致了良好的结果；这种模式也适用于NSCLC的治疗。然而，并不是所有患者都对ICIs有反应，只有10-30%的NSCLC患者有反应。这种治疗的不良反应率可能是由于ICI耐药，导致肿瘤进展的代偿途径发展，以及肿瘤细胞与免疫细胞在肿瘤微环境中的相互作用。因此，迫切需要新的预后生物标志物来提高对患者预后的预测，辅助临床决策，提高生存率和生活质量。

脊髓灰质炎病毒受体(PVR)是近年来发现的一种新的免疫检查点。PVR，也被称为分化簇，是一种免疫球蛋白样的表面分子标记，参与细胞运动和自然杀伤细胞和T细胞介导的免疫。PVR在人类各种组织中普遍表达，包括脑、胎盘、结肠、肺和白细胞。PVR过表达抑制细胞粘附，促进细胞迁移、增殖和转移。此外，PVR与几种人类恶性肿瘤的进展有关，例如结肠癌、黑色素瘤、胃癌和肺腺癌。血液高水平PVR与癌症患者预后不良相关。因此，肿瘤PVR的表达状态可作为预测预后不良的潜在生物标志物。

虽然PVR以前已经被描述过，但是关于它关于非小细胞肺癌中的作用信息仍然有限。在体内PVR敲出的动物模型研究表明，宿主和肿瘤来源的PVR表达的丢失导致肿瘤生长抑制，并增强了单独治疗或联合抗CTLA4治疗时对PD-1/PD-L1阻断的反应。此外，高水平PD-L1和PVR过度表达与小细胞肺癌患者预后不良有关。很少有研究探讨PVR和CTLA4在NSCLC中的表达状况及其相互关系。因此，本研究旨在探讨中国非小细胞肺癌患者PVR与CTLA4的相关性及肿瘤PVR表达状态对预后的预测价值。

材料与方法

病人：这是一项对年至年确诊的例非小细胞肺癌患者肿瘤样本的回顾性研究。所有病例均医院。根据组织学分类，非小细胞肺癌诊断为：肺腺癌58例，肺鳞状细胞癌50例。患者的临床病理特征包括年龄、性别、吸烟史、病理类型、肿瘤分化和肿瘤分期。所有病例均经诊断后随访，随访期间通过临床观察或电话联系获得疾病进展和生存率信息。后续随访的最后期限是年2月。

免疫组化：将石蜡包埋的NSCLC组织切成4μm厚的切片，进行免疫组织化学(IHC)染色和分析。一抗包括抗PVR(稀释1：)和抗CTLA-4(稀释1：)。所有切片均用IHC试剂盒染色。每个样品都在光学显微镜下观察。两位经验丰富的病理学家分别对IHC染色图片进行检查和分级。染色强度评分为0=阴性，1=弱，2=中度，3=强。阳性细胞百分率分为0(10%)、1(10~30%)、2(31~50%)、3(50%)。染色强度与阳性细胞百分率之和计算染色程度。染色程度分为阴性(≤1分)、低表达(2分或3分)、高表达(3分以上)。在FNAL统计分析中，低表达水平和高表达水平均为阳性。

数据分析：采用χ2检验分析PVR表达与临床病理特征的关系。用logistic回归分析确定变量对PVR表达的影响。采用ROC曲线评价PVR表达对NSCLC患者LUAD和LUSC的鉴别能力。用χ2检验评价PVR与CTLA-4表达水平的相关性。OS被定义为从病人被诊断死亡或最后一次随访的时间。采用Kaplan-Meier生存曲线和对数秩检验进行生存分析。采用Cox回归模型进行多因素生存分析。所有资料采用spss25统计软件进行分析。统计学意义为P0.05。

生物信息学分析：我们使用基因表达谱交互分析(GEPIA)数据库，在LUAD和LUSC数据集的基础上，对例非小细胞肺癌患者进行生存分析。然后我们得到了OS的生存曲线，并在基因表达的基础上进行了对数秩检验。用于PVR和CTLA4相关性分析的数据来自UCSCXena，是GDCTCGA的乳腺癌数据集(个样本)。然后，使用RStudio(1.2.)的ggpubr(0.0.2)包，采用Pearson相关法对数据进行分析和绘图。

结果

病人特征：本研究共纳入例非小细胞肺癌患者，其中LUAD58例，LUSC50例。在这些患者中，84名为男性，24名为女性。患者平均年龄58岁(35-76岁)。此外，71名患者有吸烟史。诊断结果：I期54例(50.0%)，II期32例(29.6%)，III期21例(19.4%)，IV期1例(0.9%)。低分化型、中分化型和高分化型肿瘤患者分别为23例、77例和8例。

光学显微镜观察NSCLC不同病理类型中PVR表达：采用不同病理类型的肺癌标本。图1显示了两种NSCLC病理模型中PVR的免疫组织化学结果。有趣的是，大多数肿瘤细胞和部分肿瘤浸润淋巴细胞表达PVR(阳性染色)，而邻近组织不表达PVR(阴性染色)。阳性染色信号主要位于细胞膜和胞浆。LUAD患者的高表达率(25.9%)比LUSC患者(8.0%)更常见(表1)。差异有统计学意义(P0.)。PVR蛋白在肿瘤组织中的表达高于癌旁组织。此外，根据目前的报道，PVR蛋白在LUAD患者中的表达率很高。同时，用ROC曲线评价PVR表达对NSCLC两种病理类型的鉴别能力。曲线下面积为0.(95%CI为0.-0.)，P值0.(最佳截断值=0.，敏感性=70.7%，特异性=68.0%)。因此，PVR的表达可能对鉴别非小细胞肺癌LUAD与LUSC有诊断价值(图2)。

肿瘤PVR表达与NSCLC患者临床病理特征的关系：首次研究了PVR蛋白在LUAD和LUSC细胞胞浆和表面的定位和表达。然后，我们分析了肿瘤PVR表达与NSCLC患者临床特征的关系(表2)。PVR在女性和非吸烟者中阳性率较高。在我们的样本中，75%的女性(男性为46.4%，P=0.)和75.7%的非吸烟者(吸烟者为40.8%，P=0.)呈阳性反应。这些结果明显不同。同时，PVR阳性表达与病理类型和疾病分期密切相关，说明PVR阳性表达在肺腺癌(P0.)和晚期肺癌(P=0.)中非常普遍。年龄、肿瘤分化程度对PVR表达无明显影响。单因素分析显示，性别、吸烟史、病理类型和肿瘤淋巴结转移(TNM)分期与肿瘤PVR表达有关(表3)。多因素回归分析显示TNM分期和病理类型是影响肿瘤PVR表达的危险因素(表3)。

PVR与CTLA-4表达的关系：肿瘤微环境中存在免疫检查点之间的复杂作用。因此，我们调查了PVR介导的免疫检查点通路和CTLA-4/CD28通路之间是否存在联系。首先，我们利用TCGA数据库分析了PVR和CTLA-4RNA在几种恶性肿瘤中表达的相关性。分析结果显示，乳腺癌组织中PVRRNA表达与CTLA4RNA表达呈正相关(P0.，附图1)。然而，我们的目的是调查PVR和CTLA-4在中国非小细胞肺癌患者中是否存在相关性。然后，采用免疫组化方法检测例非小细胞肺癌患者肿瘤标本中CTLA4的表达。CTLA4在肿瘤标本中主要表达在肿瘤浸润淋巴细胞中，在肿瘤细胞中也有阳性表达(图1)。CTLA-4定位于细胞膜和胞浆。χ-2统计结果显示，肿瘤标本中CTLA4的表达与PVRmRNA的表达呈正相关。结果差异有统计学意义(χ2=5.85，P=0.)(表4)。

NSCLC患者PVR表达与预后的关系：共例NSCLC患者纳入生存分析。基于IHC结果的生存分析表明，PVR阴性患者的中位OS为55.48个月，PVR阳性患者的中位OS为46.56个月。从Kaplan-Meier曲线可以看出，PVR表达阴性的患者的OS比PVR表达阳性的患者(P=0.)意义(图3)。我们提到，PVR的阳性表达与NSCLC患者的性别和吸烟史有显著的相关性。因此，我们希望研究PVR表达对不同性别和吸烟史的NSCLC患者生存时间的影响。Kaplan-Meier曲线表明，与男性和吸烟者相比，PVR的阳性表达对女性OS的缩短有更显著的影响(P=0.03)和不吸烟者(P=0.)(图4)。单因素和多因素分析表明，肿瘤TNM分期与患者OS有显著关系，晚期肿瘤分期是不良OS的独立预后指标（表5）。肿瘤PVR的表达也倾向于作为不良OS的预后指标（表5）。

此外，我们还将PVR阳性表达水平细分为高表达和低表达进行生存分析。然后，我们通过对数秩检验对PVR表达水平进行成对比较。很可能，由于我们的样本量较小，我们的配对比较结果显示，只有阴性组和高表达组的比较有显著性差异(P=0.，补充表1)。然而，Kaplan-Meier曲线显示，随着PVR表达水平的升高，NSCLC患者的生存率呈下降趋势(补充图2)。这一观察结果也支持了我们先前的观点，即PVR阳性表达，尤其是高表达，对NSCLC患者的预后不利。最后，我们还利用GEPIA数据库分析了PVRmRNA表达对非小细胞肺癌(LUAD和LUSC)患者OS的影响。生物信息学分析显示，pvr高表达的非小细胞肺癌患者的生存率低于pvr低表达的患者(P=0.，附图3)。这一结果也与我们的观点一致。

结论

在这组中国非小细胞肺癌患者中，PVR与肿瘤CTLA-4的表达呈正相关。肿瘤PVR表达是女性和非吸烟者晚期癌症(TNM)患者OS的重要预测因子。提示PVR是NSCLC潜在的诊断和预后生物标志物，并可能参与抗CTLA-4免疫治疗的肿瘤反应。

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